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Testes de laboratório para o diagnóstico de Bronquite Infecciosa (BI)

• Isolamento viral
• Sorologia (Determinação de anticorpos)
  • Teste de Precipitação em Agar Gel (AGP)
  • Teste de Vírus Neutralização (NV)
  • Teste de Inibição de Hemaglutinação (HI)
  • Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

Isolamento do Vírus - Detecção de antígenos

O isolamento viral geralmente é feito em ovos embrionados SPF (Specific Pathogen Free) com 9-10 dias dias de incubação. Pode ser necessário fazer diversas passagens cegas antes da observação dos sinais clínicos característicos do VBI. As lesões típicas nos embriões ocorrem 5-7 dias pós-inoculação, com enrolamento, nanismo, petéquias e hemorragias. Também podem aparecer uratos nos rins. Culturas de tecido traqueal (anéis traqueais) também podem ser usadas para isolamento dos vírus da BI.  Neste caso, a estase ciliar e as lesões ao epitélio traqueal são observadas entre 48 e 72 horas após a inoculação, quando os anéis traqueais são observados sob microscopia de baixa potência.  Este método fornece resultados mais rapidamente do que o uso de ovos embrionados, porém a identidade do isolado como BI deve ser confirmada por outros métodos, uma vez que o IBV não é o único patógeno que pode causar estase ciliar do epitélio traqueal.

[imagem não exibida no email]

Teste de Imunofluorescência com anticorpos conjugados com fluorescina que se ligam ao VBI quando presente em esfregaços traqueais.

Isolamento viral - detecção do genoma

• O RT-PCR é utilizado com "primers" específicos para detectar o genoma do vírus em amostras de traquéia, ovos embrionados ou em culturas de órgãos de traquéia. Tipificação do vírus da bronquite infecciosa (VBIG) por meio de RT-PCR e RFLP.
• O RFLP, que reconhece o genoma do VBI, é utilizado para determinar o genotipo. Tipificação do vírus da bronquite infecciosa (VBIG) por meio de RT-PCR e RFLP
• Tipificação do VBIG por meio das seqüências de ácidos nucléicos
• Tipificação do VBIG pela RT-PCR em tempo real

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Detecção de anticorpos

Testar amostras de soro em intervalos (por exemplo, no surgimento dos sinais clínicos e duas ou três semanas mais tarde) fornece a base para diagnósticos sorológicos. Isto também se aplica ao monitoramento dos resultados da vacinação.

Teste de Precipitação em Agar Gel (AGP)

Pouco tempo após a infecção, ocorre um repentino aumento de anticorpos precipitantes, o que depois é seguido por uma redução. O teste não é específico para sorotipos, mas pode ser útil para detectar uma infecção de BI que ocorreu recentemente. Ele tem a vantagem de ser rápido e fácil de realizar. Para fazer este teste, são feitos dois furos em um gel de agar que permite que o VBI conhecido possa correr no gel e se ligar se o soro suspeito for positivo. Uma interação entre o antígeno e os anticorpos específicos para VBI no gel resulta na precipitação do antígeno, que aparece como uma linha visível de identidade no gel.

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Teste de Vírus Neutralização (VN)

O teste de vírus neutralização (VN) é o método mais preciso disponível para fazer a diferenciação entre os sorotipos de VBI e também para confirmar a identidade de novos sorotipos. Para fazer o teste, é necessário ter uma cultura de cada vírus de BI de interesse, bem como um anti-soro monoespecífico para cada um. Estes anti-soros específicos são muito importantes para se fazer uma diferenciação precisa dos sorotipos. Cada qual é preparado através da inoculação intranasal de um grupo de galinhas SPF com um dos sorotipos de IBV de interesse. O sangue é coletado das galinhas 3 a 4 semanas mais tarde e o soro obtido deste sangue contém os anticorpos específicos do sorotipo para o vírus BI que foi inoculado.

Em exames laboratoriais, como ovos embrionados de galinhas ou culturas de órgão de traquéia, cada vírus de interesse é testado contra o anti-soro específico criado para cada um desses VBIs. Isto pode ser feito de duas maneiras, seja ao testar uma diluição de cada anti-soro contra uma série de diluições de vírus ou (e com maior precisão) através do teste de uma quantidade conhecida de cada vírus contra uma série de diluições do anti-soro. Neste sistema, como demonstrado abaixo, é possível produzir uma tabela que apresenta o título de cada vírus de BI contra o soro para o sorotipo homólogo (o mesmo) de VBI, bem como para os IBVs heterólogos (diferentes). Quanto mais alto o título, maior a relação entre os VBIs. Assim, é possível dizer se um isolado de campo é uma variante "nova" ou se ela é relacionada a um sorotipo já conhecido de VBI.

Tabela: Relação sorológica entre os vírus de BI (cepas de vacina e de desafio)

^aTítulo homólogo em negrito
^bbTítulo</= 1:20
^cNão realizado

(Cook et al, 1999)

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Teste de Inibição de Hemaglutinação (HI)

O VBI não aglutina espontaneamente células vermelhas de sangue de galinhas. Ele deve ser tratado com uma enzima neuraminidase para isso.

O teste é uma possível alternativa ao teste de VN, sendo que é muito mais simples e mais rápido de fazer. O teste de HI pode ser específico ao sorotipo se for realizado por pessoas experientes e sob condições laboratoriais altamente controladas. Isto acontece porque quando galinhas foram expostas a mais de um sorotipo diferente de BI, há um nível mais alto de reações cruzadas entre os sorotipos de BI neste teste do que no teste de VN.

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Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)

Anticorpos existentes no soro se ligam ao vírus, que se fixa no fundo de uma placa plástica de 96 poços. O complexo é detectado pela anti-γ-globulina marcada com enzima. Depois do acréscimo de um substrato de enzimas, o produto colorido resultante é medido. Este ensaio não é específico ao sorotipo, mas é útil como um teste para confirmar a resposta adequada de anticorpos, por exemplo, na vacinação. Kits comerciais deste teste estão disponíveis.

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