Isolamento viral - detecção do genoma

Tipificação do vírus da bronquite infecciosa (VBIG) por meio de RT-PCR e RFLP

A seqüência da proteína de espícula do VBIG é única e pode, portanto, ser utilizada para identificar os diferentes tipos do vírus. Primeiramente, utiliza-se a RT-PCR para amplificar o gene da espícula e, então, enzimas de restrição que funcionam como tesouras moleculares, as quais cortam o produto ampificado em posições de comprimento único chamados de fragmentos de restrição. Quando visualizados em gel de agarose, os fragmentos de restrição formam um padrão que pode ser utilizado para identificar os diferentes tipos de VBIG na amostra. Esta técnica pode identificar todos os sorotipos conhecidos do virus e suas variantes. Além disso, permite reconhecer a presença de mais de um tipo de vírus na amostra.

RT-PCR/RFLP para VBIG

RFLP do gene S1 do VBIG amplificado por  RT-PCR

Tipificação do VBIG por meio das seqüências de ácidos nucléicos

A tipificação do VBIG também é possível por meio da seqüência do ácido nucléico. Normalmente, amplificam-se em RT-PCR as regiões hipervariáveis do gene da glicoproteína da espícula, as quais são regiões de seqüências muito variáveis, que têm relação com o tipo de VBIG. O produto amplificado pode ser diretamente seqüenciado para determinar o tipo de VBIG na amostra. Além disso, a seqüência pode ser utilizada para buscar no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), que é um banco de dados de ácidos nucléicos provenientes de todo o mundo. A análise filogenética que se realiza com os vírus na base de dados permite estabelecer a relação entre os vírus.

chromatogram

Tipificação do VBIG pela RT-PCR em tempo real

A RT-PCR em tempo real é a reação de RT-PCR que inclui um corante fluorescente ou sonda marcada que se utiliza para a detecção do DNA amplificado à medida que este está sendo produzido. A vantagem da RT-PCR em tempo real é que a mesma pode ser realizada em minutos e é quantitativa. Foram desenvolvidas provas de RT-PCR em tempo real específicas para o VBIG (Callison et al. J. Virol. Methods 138:60-65, 2006).

A fluorescência é monitorada durante a amplificação da PCR

Ct = limiar do ciclo ou número do ciclo no qual a quantidade de fluorescência indica que a amostra é positiva. Quanto menor é o valor de Ct, maior a quantidade de vírus na amostra.