O isolamento viral geralmente é feito em ovos embrionados SPF (Specific Pathogen Free) com 9-10 dias dias de incubação. Pode ser necessário fazer diversas passagens cegas antes da observação dos sinais clínicos característicos do VBI. As lesões típicas nos embriões ocorrem 5-7 dias pós-inoculação, com enrolamento, nanismo, petéquias e hemorragias. Também podem aparecer uratos nos rins. Culturas de tecido traqueal (anéis traqueais) também podem ser usadas para isolamento dos vírus da BI. Neste caso, a estase ciliar e as lesões ao epitélio traqueal são observadas entre 48 e 72 horas após a inoculação, quando os anéis traqueais são observados sob microscopia de baixa potência. Este método fornece resultados mais rapidamente do que o uso de ovos embrionados, porém a identidade do isolado como BI deve ser confirmada por outros métodos, uma vez que o IBV não é o único patógeno que pode causar estase ciliar do epitélio traqueal.
Comparação de um embrião de galinha normal de 18 dias (à direita) e dois embriões infectados da mesma idade apresentando nanismo
Teste de Imunofluorescência com anticorpos conjugados com fluorescina que se ligam ao VBI quando presente em esfregaços traqueais.
Testar amostras de soro em intervalos (por exemplo, no surgimento dos sinais clínicos e duas ou três semanas mais tarde) fornece a base para diagnósticos sorológicos. Isto também se aplica ao monitoramento dos resultados da vacinação.
Teste de Precipitação em Agar Gel (AGP)
Pouco tempo após a infecção, ocorre um repentino aumento de anticorpos precipitantes, o que depois é seguido por uma redução. O teste não é específico para sorotipos, mas pode ser útil para detectar uma infecção de BI que ocorreu recentemente. Ele tem a vantagem de ser rápido e fácil de realizar. Para fazer este teste, são feitos dois furos em um gel de agar que permite que o VBI conhecido possa correr no gel e se ligar se o soro suspeito for positivo. Uma interação entre o antígeno e os anticorpos específicos para VBI no gel resulta na precipitação do antígeno, que aparece como uma linha visível de identidade no gel.
Teste de Vírus Neutralização (VN)
O teste de vírus neutralização (VN) é o método mais preciso disponível para fazer a diferenciação entre os sorotipos de VBI e também para confirmar a identidade de novos sorotipos. Para fazer o teste, é necessário ter uma cultura de cada vírus de BI de interesse, bem como um anti-soro monoespecífico para cada um. Estes anti-soros específicos são muito importantes para se fazer uma diferenciação precisa dos sorotipos. Cada qual é preparado através da inoculação intranasal de um grupo de galinhas SPF com um dos sorotipos de IBV de interesse. O sangue é coletado das galinhas 3 a 4 semanas mais tarde e o soro obtido deste sangue contém os anticorpos específicos do sorotipo para o vírus BI que foi inoculado.
Em exames laboratoriais, como ovos embrionados de galinhas ou culturas de órgão de traquéia, cada vírus de interesse é testado contra o anti-soro específico criado para cada um desses VBIs. Isto pode ser feito de duas maneiras, seja ao testar uma diluição de cada anti-soro contra uma série de diluições de vírus ou (e com maior precisão) através do teste de uma quantidade conhecida de cada vírus contra uma série de diluições do anti-soro. Neste sistema, como demonstrado abaixo, é possível produzir uma tabela que apresenta o título de cada vírus de BI contra o soro para o sorotipo homólogo (o mesmo) de VBI, bem como para os IBVs heterólogos (diferentes). Quanto mais alto o título, maior a relação entre os VBIs. Assim, é possível dizer se um isolado de campo é uma variante "nova" ou se ela é relacionada a um sorotipo já conhecido de VBI.
Tabela: Relação sorológica entre os vírus de BI (cepas de vacina e de desafio)
Vírus | País de origem | Título de neutralização recíproca contra esses anti-soros, utilizando100 CD50 de cada cepa de vírus | ||||||||||
Ma5 | 4/91 | D207 | D1466 | Ark. | TM86 | FB3 | A1121 | 890 | 57/96 | 62/96 | ||
Ma5 | - | 560a |
-b |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
25 |
4/91 | RU | - |
800 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
D207 | Holanda | - |
- |
340 |
- |
- |
- |
- |
NDc |
- |
ND |
ND |
D1466 | Holanda | - |
- |
- |
100 |
- |
- |
- |
ND |
- |
ND |
ND |
Arkansas | EUA | - |
- |
- |
- |
160 |
- |
- |
ND |
- |
ND |
ND |
TM 86 | Japão | - |
- |
- |
- |
- |
560 |
25 |
ND |
ND |
ND |
ND |
FB3 | Japão | - |
38 |
- |
- |
- |
- |
1000 |
ND |
ND |
ND |
ND |
A1121 | Taiwan | - |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1000 |
- |
- |
- |
890/80 | África do Sul | - |
- |
- |
- |
- |
ND |
ND |
ND |
490 |
- |
ND |
57/96 | Brasil | - |
- |
- |
- |
- |
ND |
ND |
ND |
ND |
110 |
ND |
62/96 | Brasil | - |
- |
- |
- |
- |
ND |
ND |
ND |
ND |
- |
110 |
aTítulo homólogo em negrito
bbTítulo</= 1:20
cNão realizado
Teste de Inibição de Hemaglutinação (HI)
O VBI não aglutina espontaneamente células vermelhas de sangue de galinhas. Ele deve ser tratado com uma enzima neuraminidase para isso.
O teste é uma possível alternativa ao teste de VN, sendo que é muito mais simples e mais rápido de fazer. O teste de HI pode ser específico ao sorotipo se for realizado por pessoas experientes e sob condições laboratoriais altamente controladas. Isto acontece porque quando galinhas foram expostas a mais de um sorotipo diferente de BI, há um nível mais alto de reações cruzadas entre os sorotipos de BI neste teste do que no teste de VN.
Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)
Anticorpos existentes no soro se ligam ao vírus, que se fixa no fundo de uma placa plástica de 96 poços. O complexo é detectado pela anti-γ-globulina marcada com enzima. Depois do acréscimo de um substrato de enzimas, o produto colorido resultante é medido. Este ensaio não é específico ao sorotipo, mas é útil como um teste para confirmar a resposta adequada de anticorpos, por exemplo, na vacinação. Kits comerciais deste teste estão disponíveis.